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如何正確的凍存細胞
更新時間:2015-09-07   點擊次數:1378次

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。現在我們就來講講如何正確的凍存細胞:

一、材料

(一)儀器   1. 凈化工作臺   2. 離心機   3. 恒溫水浴箱   4. 冰箱(4℃、-20℃、-70℃)   5. 倒置相差顯微鏡   6. 培養箱   7. 液氮冰箱

(二)玻璃器皿   1. 吸管(彎頭、直頭)   2. 培養瓶   3. 玻璃瓶(250ml、100ml)   4. 廢液缸

(三)塑料器皿   1. 吸頭   2. 槍頭   3. 膠塞   4. 移液管(10ml)   5. 15ml離心管   6. 凍存管(1~2ml)

(四)其他物品   1. 微量加樣槍   2. 紅血球計數板   3. 記號筆   4. 醫用橡皮膏   5. 移液槍

(五)試劑   1. D-Hanks液   2. 小牛血清   3. 培養液   4. 雙抗(青霉素、鏈霉素)   5. 胰蛋白酶(0.08%)   6. 1NHCl   7. 7.4%NaHCO3   8. DMSO(分析純)或無色新鮮甘油
二、操作步驟

(一)細胞凍存 

1. 配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的凍存培養液;

2. 取對數生長期的細胞,用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來,懸浮生長的細胞則直接將細胞移至15ml離心管中、;

3. 離心1000rpm,5min;

4. 去除胰蛋白酶及舊的培養液,加入適量配制好的凍存培養液,用吸管輕輕吹打使細胞均勻,計數,調節凍存液中細胞的zui終密度為5×106/ml~1×107/ml;

5. 將細胞分裝入凍存管中,每管1~1.5 ml;

6. 在凍存管上標明細胞的名稱,凍存時間及操作者;

7. 凍存:標準的凍存程序為降溫速率-1~-2℃/ min;當溫度達-25℃以下時,可增至-5℃~-10℃/   min;到-100℃時,則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ,然后放入-70℃冰箱中**,取出凍存管,移入液氮容器內。

(二) 細胞復蘇

1. 從液氮容器中取出凍存管,直接浸入37℃溫水中,并不時搖動令其盡快融化。

2. 從37℃水浴中取出凍存管,打開蓋子,用吸管吸出細胞懸液,加到離心管并滴加10倍以上培養液,混勻;

3. 離心, 1000rpm,5min;

4. 棄去上清液,加入含10%小牛血清培養液重懸細胞,計數,調整細胞密度,接種培養瓶,37℃培養箱靜置培養;

5. 次日更換一次培養液,繼續培養。

三、注意事項

1.從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養細胞都可以用于凍存,但為對數生長期細胞。在凍存前一天換一次培養液;   

2.將凍存管放入液氮容器或從中取出時,要做好防護工作,以免凍傷;   

3.凍存和復蘇用新配制的培養液。

 

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